Proceso de fermentación y extracción de la penicilina acilasa

1,1. Penicilina acilasa y sus características

Penicilina acilasa, también conocida como penicilina acilasa aminohidrolasa, o penicilina acilasa aminohidrolasa. Se obtiene principalmente de enzimas intracelulares de Escherichia coli, enzimas extracelulares de Bacillus megaceus y enzimas intracelulares de Pichia pastoris. Se ha utilizado ampliamente en la producción de importantes intermedios de antibióticos β-lactámicos y antibióticos β-lactámicos semisintéticos. La penicilina acilasa es una enzima que cataliza específicamente las reacciones de penicilina. La penicilina acilasa se utiliza principalmente en el proceso de producción de ácido 6-aminopenicilánico (6-APA). 6-APA se obtiene principalmente desacilando penicilina G a través de penicilina acilasa. Además, debido a las propiedades antibacterianas, antigénicas y alergénicas de la penicilina acilasa, es difícil ser descompuesto por enzimas en las células bacterianas; además, debido a la fácil formación de residuos de antibióticos β-lactámicos por la penicilina acilasa y el problema de la carcinogenicidad, El tratamiento y el control de tales sustancias siempre ha sido un problema difícil en el campo de la investigación con antibióticos.

1,2. ¿Qué es la acilación?

La acilación también se llama acilación. La acilación se refiere a la reacción de introducción de acilo RCO alifático-o acilo aromático ArCO-en átomos de nitrógeno, oxígeno, carbono o azufre en moléculas orgánicas. Los productos después de la acilación son compuestos como cetonas (aldehídos), amidas y ésteres. Las reacciones de acilación se pueden dividir en Acilación de oxígeno, Acilación de nitrógeno y Acilación de carbono según el sitio de introducción de acilo. Los agentes de acilación son generalmente ácidos carboxílicos o derivados de ácidos carboxílicos. Las reacciones de acilación también se pueden clasificar según el tipo de agentes acilantes.

2 Método de extracción de la penicilina acilasa

Cómo reciclar y purificar la penicilina acilasa, especialmente usando Escherichia coli o Pichia pastoris para la ingeniería genética. Este es un vínculo muy importante, y este paso tiene un gran impacto en la calidad de la penicilina acilasa.

2,1. Interrupción ultrasónica. Cromatografía

La disrupción ultrasónica, la cromatografía y la purificación de extracción son técnicas de bioseparación de uso común que se pueden utilizar para separar, purificar y extraer biomacromoléculas como proteínas y ácidos nucleicos. Todo el proceso generalmente se lleva a cabo a baja temperatura (0 ~ 4 ℃) para evitar la degradación y el daño de la muestra. En este estudio, Escherichia coli se utilizó como las principales bacterias modificadas genéticamente para la extracción de líquido enzimático crudo. La Eliminación de la pared celular, el ácido nucleico y las partes lipídicas en el extracto puede hacer que la proteína diana sea más pura y más estable. Para obtener mejores resultados, el estudio adoptó una variedad de métodos de purificación eficientes como el método de sedimentación segmentada con sulfato de amonio, el método de columna cromatográfica, el método de ingeniería de diseño de fibra dietética DAE-52 cromatografía en columna, gel material-200-hydroxyapatite cromatografía en columna, etc. Los estudios han demostrado que la actividad específica de la solución enzimática bruta de Escherichia coli es pobre, Y generalmente se requieren de cuatro a cinco etapas de purificación para obtener una actividad específica más alta. La tecnología de trituración ultrasónica, cromatografía y purificación de extracción se puede utilizar eficazmente para purificar la solución enzimática bruta de Escherichia coli, proporcionando una base confiable para la investigación y aplicación funcional posterior.

2,2. Impacto presión osmótica

La tecnología de pulso de alta presión es ampliamente utilizada en la extracción y purificación de biomacromoléculas. La penicilina acilasa es una proteasa intracelular distribuida principalmente en la membrana celular y la pared celular, y a menudo se usa en la preparación de antibióticos. En este estudio, la penicilina acilasa se extrajo mediante tecnología de pulso de alta presión y la solución enzimática bruta obtenida tenía una mayor actividad. Mediante precipitación con solución acuosa de sulfato de amonio, se puede obtener una mayor velocidad de reacción a la vez y se puede aplicar directamente a la inmovilización. Para extraer eficazmente la penicilina acilasa, el estudio utilizó el método de choque de presión osmótica, que es un método de extracción simple y fácil que no requiere demasiados instrumentos y tiene una amplia gama de aplicaciones. Este método moja Escherichia coli en una solución hipertónica y luego la mueve a un medio hipotónico. Mediante la acción de la presión osmótica, la pared celular se rompe y la enzima se excreta del cuerpo. Este método puede prevenir el problema de la liberación excesiva de sustancias contenidas debido a la ruptura completa y mantener efectivamente la tasa de supervivencia de las bacterias. Después de obtener la enzima en bruto, se puede purificar mediante métodos como precipitación con sulfato de amonio y análisis de cromatografía en columna DEAE-cellulose-52 para obtener una enzima de electroforesis en gel de poliacrilamida con una estructura de banda única. Es precisamente por culpa deEl método de impacto de presión osmótica que la integridad de la pared celular y la tasa de supervivencia bacteriana se mantienen durante el proceso de extracción, obteniendo así una solución enzimática bruta con mayor actividad específica. Además, este método de extracción también ayuda a retener la estructura de la banda enzimática, lo que ayuda a obtener penicilina acilasa de alta pureza y alta actividad específica.

2,3. Tratamiento adsorbente

La penicilina acilasa es una enzima importante y tiene un valor de aplicación importante en la preparación de antibióticos. En este estudio, con el fin de separar la penicilina acilasa del caldo de fermentación, se utilizó el método de adsorción para la separación. El Uso de hidróxido de amonio para tratar la tierra de diatomeas puede extraer directamente la penicilina acilasa y operar a temperatura ambiente, con un alto rendimiento de actividad enzimática y buenas perspectivas de aplicación industrial. Para la recolección de bacterias, el consumo de energía del método de separación centrífuga es alto debido al pequeño tamaño de los microorganismos y la dificultad en la precipitación. Además, el método de floculación única no puede recolectar completamente las bacterias. Por lo tanto, se puede utilizar una combinación de floculantes y tecnología de centrifugación para recolectar bacterias para mejorar la eficiencia de recolección y reducir el consumo de energía centrífuga. Hay muchos factores que afectan la actividad enzimática durante la producción y extracción de la penicilina acilasa, como el tipo, la concentración, la temperatura, etc. de los disolventes. El Método de ajustar la dosis y el valor de pH de la enzima extraída también es muy crítico. Por lo general, el caldo de fermentación se puede tratar previamente para maximizar la actividad enzimática, y luego se agrega el adsorbato y se separa la penicilina acilasa. Este método puede hacer que la producción y separación de la penicilina acilasa sea más eficiente y estable.

3 Proceso de fermentación de la penicilina acilasa

3,1. Preparación de esporas

Para las cepas mejoradas del suelo arenoso, la mejora genética puede llevarse a cabo usando medios de cultivo que contienen glicerol, glucosa, proteína, etc. En las condiciones de crecimiento de la temperatura óptima de 25-26 ℃ Y 6-8 días, se pueden obtener colonias individuales y se puede realizar una propagación inclinada, Y las esporas inclinadas se pueden obtener después de 7 días. Estas esporas se pueden trasplantar a grano de alta calidad o medio de cultivo sólido de arroz, y el cultivo de la cepa de mijo con 3 etapas de crecimiento durante 7 días a 25 ℃ necesita agregar más fuente de carbono y fuente de nitrógeno orgánico para obtener una gran cantidad de hifas. Para las esporas producidas durante el proceso de fermentación, se deben realizar experimentos en matraz de batido para verificar la eficacia y el estado de las bacterias extrañas. Además, durante el proceso de cultivo de tanques de semillas y tanques de fermentación, es necesario obtener una gran cantidad de hifas agregando una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno orgánico. Proceso de fermentación para la producción de penicilina Durante la fermentación de la penicilina acilasa, se requiere un alto contenido de oxígeno disuelto y una velocidad de ventilación, y el caudal de aire suele ser 1:1 ~ 1:5. La velocidad de agitación debe ser moderada, generalmente de 150 ~ 200r/min. En la etapa inicial de la fermentación, el poder de agitación es grande, lo que puede promover el crecimiento de las bacterias. Además, el control de parámetros como el tiempo y la temperatura en cada etapa de la fermentación también debe ajustarse de acuerdo con diferentes cepas y condiciones de fermentación. El tanque de fermentación es el eslabón principal en la producción a gran escala de penicilina acilasa. En el tanque de fermentación, una variedad de sustancias, como polvo de pastel de maní, polvo de salvado, jarabe de maíz, glucosa, urea, etc., se puede agregar para mejorar el estado nutricional y la tasa de crecimiento de las bacterias. Al inocular, se recomienda controlar la cantidad de inoculación de micelio entre 12% y 15% para evitar el desperdicio y reducir los costos. Además, al manipular el líquido residual generado durante el proceso de fermentación, se debe prestar atención a la protección del medio ambiente. El líquido residual puede contener una variedad de sustancias nocivas y contaminantes, que deben tratarse y descargarse estrictamente.

3,2. Control de fermentación de la penicilina acilasa

El proceso de preparación de la penicilina acilasa obtuvo penicilina acilasa bajo medio de cultivo adecuado, temperatura, ventilación y condiciones de cultivo de agitación. Antes de la fermentación, el equipo y los medios relevantes (principalmente fuente de carbono, fuente de nitrógeno, precursor y sal inorgánica) se desinfectan, y luego se conecta el líquido de la semilla. Durante este período, para mantener una cierta temperatura y presión, a menudo se agregan desespumantes. Si el valor de pH del líquido de fermentación está controlado por ácido y álcali, las sales de glucosa y amonio deben agregarse de forma intermitente o continua para complementar la fuente de carbono y la fuente de nitrógeno, u otros precursores líquidos deben agregarse para aumentarEl rendimiento de la penicilina acilasa.

3,3. Características del proceso de fermentación de la penicilina acilasa

En el proceso de producción de penicilina acilasa, la solución de azúcar es uno de sus principales nutrientes, y el contenido de la solución de azúcar puede afectar directamente la producción y el rendimiento de la penicilina acilasa. Si la tasa de adición de azúcar es demasiado baja, la tasa de crecimiento del micelio disminuirá, lo que afectará la actividad y la producción de las bacterias, mientras que una alta proporción de azúcar hará que la viscosidad del líquido de fermentación aumente, el número de micelio aumente y el oxígeno disuelto disminuya rápidamente, Afectando el progreso normal de la fermentación. Por lo tanto, para producir una acilasa de penicilina eficiente, el contenido de la solución de azúcar debe controlarse con precisión. En la actualidad, se suele utilizar una determinada curva de contenido de azúcar, que se basa en datos experimentales y se ha optimizado y mejorado. Sin embargo, dado que las materias primas de cada lote de producción son diferentes, y las características de cada lote de variedad son diferentes debido a los diferentes germoplasmas, si solo se utiliza la misma curva de contenido de azúcar para la adición, algunos productos tendrán rendimientos insuficientes. Por lo tanto, cómo ajustar con precisión el contenido de azúcar de acuerdo con el estado metabólico del micelio es una de las claves para controlar el proceso de producción de la penicilina acilasa. Se pueden utilizar diferentes curvas de contenido de azúcar para el ajuste de acuerdo con el estado metabólico del micelio. Cuando el número de micelio es pequeño en la etapa inicial de la fermentación, la tasa de adición de azúcar de la solución de azúcar se puede aumentar gradualmente para acelerar la tasa de crecimiento del micelio. Al mismo tiempo, en las etapas media y tardía de la fermentación, se debe controlar el contenido de la solución de azúcar para evitar la acumulación excesiva de azúcar que afecta el metabolismo normal del líquido de fermentación. Además, la curva de contenido de azúcar se puede ajustar dinámicamente de acuerdo con el contenido de solución de azúcar detectado en tiempo real, para controlar con mayor precisión el contenido de solución de azúcar.

4 Proceso de extracción de la penicilina acilasa

4,1. Pretratamiento

Una vez completada la fermentación, existe en el caldo de fermentación Monascus en forma de una intensidad mínima de 10 ~ 30kg/m3, que contiene una gran cantidad de Iones inorgánicos con alto contenido de oxígeno (Ca, Mg, Fe), micelio, medio de cultivo no utilizado, células fácilmente contaminadas, metabolitos de patógenos, proteínas, Etc. Su propósito principal es enriquecer el producto objetivo y eliminar una gran cantidad de impurezas para una mayor separación y purificación.

4,2. Filtración

El caldo de fermentación debe ser pretratado antes de la extracción. Se puede agregar una pequeña cantidad de floculante (como alumbre) al caldo de fermentación, o el valor de pH del caldo de fermentación se puede ajustar al punto isoeléctrico de la proteína para precipitar la proteína, Y luego el líquido flotante se bombea en cada Cámara de filtro sellada del filtro a través de un tambor de vacío (usando presión negativa como potencia de filtración) o un cartucho de filtro plano. Bajo presión de trabajo, la separación sólido-líquido se logra a través de una membrana de filtro u otras tortas de filtro. Dado que la penicilina acilasa se degrada fácilmente a temperatura ambiente, la temperatura del caldo de fermentación y el filtrado es inferior a 10 ° C, y su rendimiento es superior a 90%.

4,3. Extracción

La penicilina acilasa se aisló de la penicilina acilasa por extracción con disolvente. Es un método para concentrar y purificar antibióticos de una fase líquida (e. G. Filtrado de fermentación) a otra fase líquida (e. G. disolvente orgánico) en diferentes condiciones de pH, en diferentes Estados químicos (ácido libre o sales), en disolventes que son insolubles en agua. Dado que hay un grupo carboxilo en la estructura de las moléculas de acilasa de penicilina y su pKa es 2,75, se forma ácido libre cuando su solución acuosa se acidifica a un valor de pH de aproximadamente 2,0. El ácido de la penicilina acilasa tiene una solubilidad extremadamente baja y buenas propiedades de extracción de disolventes en alcoholes, cetonas, éteres, ésteres, etc., por lo que se puede separar y purificar del caldo de fermentación.

La penicilina acilasa se transfiere a un disolvente orgánico en un ambiente ácido, el valor de pH se ajusta a aproximadamente 2,0, y luego entra en una fase acuosa neutra, se extrae varias veces y finalmente se purifica. La penicilina acilasa con un coeficiente de partición más alto se usa generalmente. El acetato de butilo y el acetato de n-pentilo se utilizan principalmente en la producción industrial. El pH del acetato de butilo extraído del caldo de fermentación es de 1,8 ~ 2,0, y el valor del pH del acetato de butilo extraído en la fase acuosa es de 6,8 ~ 7,4. Los resultados experimentales muestran que la relación entre el filtrado de fermentación y la solución de acetato de butilo es 1,5 ~ 2,1. Las soluciones tampón de sulfato y carbonato somos nosotrosEd para la extracción de espalda para evitar fluctuaciones de pH. La Proporción de caldo de fermentación a solución es de 3 ~ 4. Después de múltiples extracciones y 10 concentraciones, su concentración básicamente cumple con las condiciones de cristalización, y el rendimiento total de extracción alcanza 85%. La solución de tamizado obtenida es principalmente extracción secundaria, utilizando solución de ácido sulfúrico 10% con un pH de 2,0 ~ 3,0, y luego se agrega acetato de butilo, cuya cantidad es aproximadamente el 1/3 de la solución de tamizado, y la extracción posterior generalmente se lleva a cabo con solución acuosa de bicarbonato de sodio con un pH de 7,0 ~ 8,0. Durante el proceso de extracción primaria, debido a la alta concentración de proteínas en la filtración, es necesario agregar un demulsificador. El primer paso es la extracción, que contiene proteínas y la adición de PPB 0.05% ~ 0.1%.

4,4. Extracción

Para reducir la degradación de la penicilina acilasa, debe llevarse a cabo a una temperatura baja por debajo de 10 ℃. La salmuera en el tanque de extracción se congela. Durante la extracción, la temperatura y la acidez tienen una gran influencia en la degradación de la penicilina acilasa, que es un factor importante que afecta su degradación. Muchos académicos han realizado muchas investigaciones al respecto y han realizado una discusión detallada sobre la influencia de la temperatura y la humedad de las aguas residuales de diferentes valores de pH en su vida media de degradación. Los resultados muestran que el rango de estabilidad de la penicilina acilasa es pH 5,0 ~ 8,0, y muestra una fuerte estabilidad a pH 6,0, y puede degradarse rápidamente tanto en condiciones ácidas como alcalinas. A través del ajuste de la curva, se obtiene la relación entre la vida media de degradación de la penicilina acilasa a diferentes temperaturas y el valor del pH.

4,5. Cristalización

El carbón activado se añade al extracto para eliminar pigmentos, fuentes de calor, filtrar y eliminar el carbón activado. El extracto generalmente se refina por cristalización. En el acetato de butilo, dado que la solubilidad de la sal de potasio de penicilina acilasa es muy baja, la sal de potasio de penicilina acilasa cristalizará después de agregar acetato de potasio-etanol. Sobre esta base, el potasio se disuelve en solución acuosa de KOH mediante el método de recristalización, el valor de pH se ajusta a neutro, se añade butanol y, finalmente, el producto puro se obtiene mediante destilación azeotrópica. (1) Método de cristalización directa: El Extracto de acetato de butilo se hace reaccionar con acetato de sodio-etanol para obtener sal de sodio cristalina. La sal de potasio de la penicilina acilasa se obtiene mezclando acetato de potasio-etanol-acetato de potasio. (2) Método de destilación azeotrópica: Después de la extracción, se extrae con hidróxido de sodio 0,5 mol/l y el valor de pH se ajusta a 6,4 ~ 6,8 para obtener solución salina fisiológica que contiene sodio. A 16 ~ 26 ℃ Y 0,67 ~ 1,3 kPa, se añade 2,5 veces butanol. El agua y el n-butanol se evaporan azeotrópicamente. Se precipitan cristales de iones de sodio. Los cristales se lavan y se secan para obtener productos de penicilina acilasa.